Unter spanischer Kontrolle wurde Florida zu einem Stützpunkt für weitere Erkundungen und Kolonisierungen in Amerika. Spanische Konquistadoren nutzten Florida als Ausgangspunkt für Expeditionen in andere Teile der Neuen Welt, darunter Mexiko und Peru. Die Spanier gründeten auch Missionen in Florida, um die einheimische Bevölkerung zum Katholizismus zu bekehren.
Trotz dieser frühen Bemühungen war die Kontrolle Spaniens über Florida begrenzt. Die Region war dünn besiedelt und die spanischen Siedlungen waren oft anfällig für Angriffe einheimischer Stämme. Darüber hinaus wurden die Spanier von Franzosen und Engländern herausgefordert, die ebenfalls Ansprüche auf die Region hatten.
Im Jahr 1562 gründeten die Franzosen Fort Caroline im heutigen Jacksonville, Florida. Die französische Kolonie war jedoch nur von kurzer Dauer, da die Spanier sie 1565 zerstörten. 1607 gründeten die Engländer Jamestown in Virginia. Die englische Kolonie war erfolgreicher als die französische Kolonie und entwickelte sich schließlich zu einer Großmacht in der Region.
Bis zum Ende des 17. Jahrhunderts beschränkte sich Spaniens Kontrolle über Florida weitgehend auf die Küstengebiete um St. Augustine. Im Jahr 1763 überließ Spanien Florida im Austausch gegen Kuba, das im Siebenjährigen Krieg von den Briten erobert worden war, an Großbritannien.
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